步入仕途

嘉靖十九年二月二十一日（1540年3月29日），吴中行出生于河南南阳府南阳县（今河南省南阳市），当时其父吴性正担任南阳教谕。

嘉靖四十年（1561年），吴中行考中应天府乡试，吴性告诫他不要急于追求功名，于是他没有参加会试。

隆庆五年（1571年），吴中行考中进士。六月十二日（7月3日），明穆宗考选翰林院庶吉士，令吴中行进入翰林院读书。

万历元年五月九日（1573年6月8日），吴中行被授职翰林院编修。

忤张罢归

万历五年（1577年），张居正的父亲去世，而张居正没有解职回乡奔丧，仍旧执掌朝政。御史曾士楚、吏科都给事中陈三谟首先上疏奏请让他留下，满朝大臣都随声附和，唯独吴中行很气愤。刚好彗星出现在西南方，长度竟达到天际，明神宗下诏让百官反省。吴中行于是在十月二十二日（12月1日）带头上疏弹劾张居正。

奏疏已经上了，吴中行把副本告诉张居正。张居正惊讶地说：“奏疏送进去了吗？”吴中行说：“没有送上不敢告诉你。”第二天，赵用贤的疏奏上。第三天，艾穆、沈思孝的奏也呈上。张居正发了火，与冯保商量，欲廷杖他们。翰林院侍讲赵志皋、张位、于慎行、张一柱、田一隽、李长春，修撰习孔教、沈懋学都上奏救他们，但奏疏都被阻止没有上报。学士王锡爵于是会同数十人，找张居正求和解，张居正不接受，于是廷杖吴中行等四人。第二天，进士邹元标上疏争辩，也被廷杖。这五个人正直的名声因此而震动天下，吴中行、赵用贤被并称为“吴赵”。南京御史朱鸿谟上疏救援五人，也被斥责。吴中行等受了廷杖后，校尉用布将他们拖出长安门，用木板抬着，当天就驱赶出都城。吴中行气息奄奄，中书舍人秦柱带来了医生，喂服了一勺子药，才苏醒。用车载着他南归，归家后，挖出腐肉数十块，大的如手掌，深寸许，一肢都挖空了。

万历九年（1581年），全面考核京官，张居正把吴中行等五人列于考察名单上，将他们禁锢不许任职。

万历十年二月二十二日（1582年3月16日），张居正已死，曾士楚应当巡按苏、松地区，他惭愧地说：“我有什么面目去见吴中行、赵用贤二位大人呢！”于是声称有病走了。陈三谟已被提为太常少卿，不久与曾士楚都被弹劾而削去职务。

官复原职

万历十一年正月五日（1583年1月28日），明神宗下诏录用因建言而除去官籍的人，吴中行被起用为旧职。五月十七日（7月6日），明神宗命吴中行参对《大明会典》校正事务。六月二日（7月20日），明神宗擢升吴中行为右中允兼翰林院编修，掌管右春坊印信。

万历十二年二月九日（1584年3月20日），吴中行升任司经局洗马，管理国子监司业事。大学士许国攻击李植、江东之，诋毁吴中行、赵用贤是他们一派的。吴中行于是在五月十一日（6月18日）上奏辩白，因而乞求回乡，明神宗没有答应。十月二十日（11月21日），吴中行升任右春坊右谕德兼翰林院侍讲，管理纂修玉牒。十二月十二日（1585年1月12日），明神宗命吴中行充任日讲官。十二月二十三日（1月23日），明神宗命吴中行充任《大明会典》纂修官。

万历十三年四月二十七日（1585年5月26日），御史蔡系周弹劾李植，又提到吴中行，吴中行请求免职，明神宗不允。直到六月三日（6月29日），明神宗才下诏赏赐白金、文绮，让吴中行乘驿马回去。后来言官屡屡推荐他，执掌大权的人有意抑制，不召他回京城。

再次起用

万历二十年十二月十四日（1593年1月16日），明神宗起用吴中行为侍读学士（《明史》作侍讲学士），执掌南京翰林院。

万历二十一年三月一日（1593年4月2日），明神宗命吴中行升任侍讲学士，当时同里之人佥事徐堂吉曾弹劾吴中行，事情已经了结，给事中王嘉谟又重提旧事弹劾他，朝廷命令他呆在家中等待征召。

万历二十二年九月三日（1594年10月16日），吴中行去世，享年五十五岁。

身后哀荣

万历二十三年十月十三日（1595年11月14日），明神宗按惯例对吴中行赐祭葬。

万历三十六年十一月十三日（1608年12月19日），河南道御史黄吉士等人请求对吴中行补予谥号，最后未予实施。

天启二年七月二十八日（1622年9月3日），明熹宗朱由校追赠吴中行为礼部右侍郎，并荫一子入国子监读书。九月十五日（10月19日），明熹宗嘉奖吴中行直谏的行为，特祭一坛。

天启四年六月四日（1624年7月18日），明熹宗荫吴中行之孙吴俨思为国子生。