初仕南梁

杜叔毗出身自京兆杜氏，其先辈自京兆杜陵（今陕西西安）迁居于襄阳（今湖北襄阳）。杜叔毗早年丧父，服侍母亲以孝顺闻名，他的个性慷慨有志向节操，学习勤奋，精通《左传》、初仕南梁，任宜丰侯萧循府中直兵参军。

宗族被害

西魏大统十七年（551年），西魏丞相宇文泰派大将军达奚武率军进攻南梁。

西魏废帝元年（552年），萧循被达奚武围困于南郑（今陕西汉中），萧循无力退敌，于是命杜叔毗到西魏请和。杜叔毗到达西魏首都长安（今陕西西安）后，丞相宇文泰对其以礼相待。

杜叔毗还在长安没有返回的时候，萧循的中直兵参军曹策、参军刘晓密谋献城向达奚武投降。当时杜叔毗的哥哥杜君锡担任萧循的中记室参军，堂侄杜映担任录事参军，杜映的弟弟杜晰担任中直兵参军，都有文武材略，各自都有数百亲兵。曹策等人心怀猜忌，害怕杜君锡等人不与自己同谋，就诬告杜君锡等人谋反，擅自将他们杀害。

萧循知道后，击败了曹策等人，并将他们擒获。但萧循只将刘晓斩首，赦免了曹策。

为亲复仇

西魏废帝元年（552年），萧循向西魏献城投降，曹策来到了长安。杜叔毗听闻后毗日夜嚎啕大哭，申诉冤情。西魏朝议认为事情发生在归附之前，不可以追溯曹策的罪行。杜叔毗内心非常愤怒，志在复仇，又担心违反朝廷法制，连累母亲，于是很长时间没有行动。母亲知道杜叔毗的意思，对他说：“你哥哥横遭重大的祸害，让人痛心彻骨。如果曹策早上死，我晚上受连累而死，也是心甘情愿。你有什么犹豫的？”杜叔毗下拜接受母亲的话，更加激励。

之后杜叔毗白天在长安亲手将曹策杀死，并曹将其斩首剖腹，肢解尸体。然后反绑双手，请求受戮。宇文泰称赞他的志气，特令赦免。

担任重职

之后，杜叔毗入仕北周，任都督、辅国将军、中散大夫。遇到母亲去世，杜叔毗过度悲伤而形销骨立，几乎不能完成丧事。服丧结束后，晋国公宇文护征辟杜叔毗担任中外府乐曹参军，加授大都督，升使持节、车骑大将军、仪同三司，行义归太守。

杜叔毗的兄长杜君锡和族人被曹策杀害后，至今还葬在梁州（今陕西汉中），此时他上表请求迎丧归葬。周武帝宇文邕同意了，诏令安葬事务所需都由官府供给，杜家在南梁旧有的田宅被外配给他人的，全部追回还给杜家，又另外赐给杜家二百顷田地。后历经数次升迁，官至硖州（今湖北宜昌）刺史。

以身殉国

北周天和二年（567年），杜叔毗随卫国公宇文直讨伐南陈，战败，杜叔毗被南陈俘虏，南陈劝说杜叔毗投降，杜叔毗坚决不从，于是被杀害。