17岁中秀才。光绪三十一年（1905年）官费留学日本早稻田大学，攻史学专业。光绪三十四年（1908年）在东京与鲁迅同随章太炎学习《说文解字》。
宣统元年（1909年）归国后，与鲁迅同受聘于浙江两级师范学堂任教。翌年改就嘉兴府中学任教。辛亥革命后公举为海盐县首任民事长，积极推行剪辫放足、破除迷信、禁止鸦片、兴办学校等新政。旋改到省教育厅任事。
朱希祖1913年（民国二年）为教育部起草国语注音字母方案，后受聘任北京大学预科教员兼清史馆编修。袁世凯称帝时，辞去编修，专任北大教授。“五四运动”前后，朱希祖常为《新青年》和《晨报》副刊撰稿。
1918年（民国七年）任北京大学中国文学系主任，教授中国文学史。不久兼任史学系主任，写成《中国史学通论》一书及许多史论。其间积极参与推行白话文。
1920年（民国九年），联合北大六教授上书教育部，要求推行新式标点，中国新式标点自此始。是年底，和沈雁冰、郑振铎、叶圣陶等12人共同发起成立文学研究会。
1921年（民国十年），为北大接收历史博物馆残存内阁大库档案1502麻袋，于研究所国学门设明清档案整理会，拟定整理办法，领导史学系学生整理研究。
1923年（民国十二年）夏，应陕西督军刘镇华之请，入关中讲学，摹拓汉唐石刻。
1926年（民国十五年）夏，改任清华、辅仁两大学教授。
1928年（民国十七年）重返北大，任史学系主任，并发起成立中国史学会。
1930年（民国十九年）入中央研究院，任研究员。
1932年（民国二十一年）任广州中山大学教授兼文史研究所所长，先后撰写《南明之国本与政权》《南明广州殉国诸王考》《中国最初经营台湾考》《屈大均传》《明广东东林党传》等数十篇论文。
1934年（民国二十三年）受聘为南京中央大学历史系主任，同年任古物保管委员会主任。教学之余，与其子朱偰对南京古迹实地调查，写出《六朝陵墓调查报告》等专著，为研究南京历史文化奠定了基石。
1935年、1936年任高等考试典试委员。
1938年（民国二十七年）随校西迁，在四川7年中，先后撰成《伪楚录辑补》《伪齐录校补》等书，以隐刺伪满和汪伪政权。
1940年（民国二十九年）任国史馆筹备委员会总干事，不久即辞国史馆职；3月，由重庆中央大学历史系主任改任考试院考选委员会委员，后兼任考试院公职候选人检核委员会主任。
1944年（民国三十三年）7月因肺气肿病发，逝于重庆。友好门生曾编印《文史杂志》专号，介绍其生平。
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