万历二十六年（1598年），祖天定之父祖承教在一次战斗中阵亡。万历二十九年（1601年），时年二十一岁的祖天定以嫡长子袭职宁远卫指挥佥事。后官至宽奠游击（一说参将）。万历四十六年（1618年），努尔哈赤入侵清河等地，祖天定因“听民出堡不禁”而被查处。他被降为都司、管宽奠游击事，翌年随刘綎的东路军出征后金。三月四日，他因上年在后金入侵清河时“坐视逗留，不赴策应”而被明廷判处戍边。同日，他就在阿布达里冈战败身亡。
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