于定国少年随其父学习法律。其父去世，于定国依次担任狱史、郡决曹，后来到长安补廷尉史，因其材高被举为侍御史，转任御史中丞。汉宣帝在位时，于定国担任光禄大夫，平尚书事。本始三年（前71年），于定国升任水衡都尉，地节元年（前69年）于定国又被擢任廷尉。于定国为人谦恭，处理案件平恕。时称“于定国为廷尉，民自以无冤”。担任廷尉十八年，甘露二年（前52年），转任御史大夫。甘露三年，代黄霸为丞相，封西平侯。永光元年（前43年）于定国致仕，韦玄成为丞相。
他的儿子于永娶汉宣帝长女馆陶公主为妻。
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