晋哀帝司马丕生于咸康七年（341年）。咸康八年（342年），受封为琅邪王。同年，晋成帝去世，本应司马丕登基，但中书令庾冰因害怕其登基后失去权势遂以司马丕年幼为理由反对，于是司马丕堂兄晋穆帝登基，改元建元。
永和元年（345年），拜散骑常侍。永和十二年（356年），加中军将军。升平三年（359年），任骠骑将军。
升平五年（361年）五月，晋穆帝去世，皇太后褚蒜子下令说司马丕本来早就该登基为帝，他是皇室正统，如今没有人比他更适合当皇帝。于是司马丕登基。 五月，司马丕登基后大赦天下，同时封弟弟司马奕为琅琊王。 同年七月，将晋穆帝安葬在永平陵；九月，立妃子王穆之为皇后。 十一月，司马丕下诏让晋穆帝、晋康帝过继给晋显宗司马衍。
隆和元年（362年）正月，前燕将领吕护、傅末波攻陷小垒，兵临洛阳。 正月十三日，推尊生母亲周氏为皇太妃，进升琅邪王司马奕为侍中、骠骑大将军、开府。 四月，吕护再次侵犯洛阳。五月，司马丕派北中郎将庾希、竟陵太守邓遐率领水军救援洛阳。七月，吕护军退守小平津。 十二月初一日，出现日食，司马丕下诏表示要减轻严峻繁琐的赋税，周详地商议法令，全部遵循减损之要。
兴宁元年（363年）正月，改元兴宁。同年二月，大赦天下。三月，司马丕生母皇太妃周氏去世于琅邪府，皇帝奔丧，诏令司徒、会稽王昱总管内外众务，同月将其下葬。后司马丕因为喜得一子而大赦天下。 同月，司马丕亲自下田劳动以发展农业。三月八日，因为司马丕一向喜欢长生不老之术，按照道士传授的长生法，断谷、服丹药，侍中高崧谏曰：“这不是好事情啊，陛下不应如此。”哀帝不听，结果服药后药性大发而不能听政，于是崇德太后褚蒜子摄政。
司马丕先任命桓温扬州刺史，后又派人让其入朝为宰相，结果桓温不同意。七月，司马丕下圣旨让桓温入朝，但八月，桓温到了赭圻后就筑城居住在那里，桓温的权势和野心暴露。
兴宁三年（365年）三年正月一日，皇后王穆之去世。 正月，司马丕因服药过多发病在西堂去世，时年二十五岁。葬在安平陵。司马丕死后谥号为哀，和王皇后并葬于安平陵。
晋哀帝没有后嗣，皇太后下达诏令，让琅邪王司马奕继承帝位。
司马丕在位期间实行土断后，又在兴宁二年（364年）三月一日再次推行，史称“庚戌土断”或“庚戌制”。 其主要精神是划定州、郡、县领域，居民按实际居住地编定户籍。这一政策有利于行政统一和节省开支。时哀帝下令各地检阅户口把800寓户口编入所在郡县，严行法禁，因364年3月1日是庚戌日，故此制亦称“庚戌制”。此制颁行后，彭城王司马玄隐匿5户，被查出后收付廷尉。在当时收效较大，但桓温死后，此法亦止。
隆和元年（362年），司马丕登基不久，下诏减轻田税，一亩只收二升。 同年八月，司马丕令袁真运送五万斛米到洛阳，同年冬十月，赏赐大米给贫穷的人，每人五斛。
司马丕的书法也很好，晋朝偏安一隅，多文墨之气，司马丕也有书法作品。《淳化阁帖》是中国最早的一部汇集各家书法墨迹的法帖，其中就收录了哀帝司马丕的书法真迹《中书贴》， 于2003年上海博物馆斥资450万美元从美国著名古董收藏家安思远处购回。
褚蒜子：琅邪王丕，中兴正统，明德懋亲。
《晋书》：哀皇宽惠，可以为君，而鸿祀禳天，用尘其德。
《晋书·卷八·帝纪第八》
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